4. PROCEDIMENT EXPERIMENTAL
4.5 Mètode analític pel seguiment del substrat
Pel seguiment del consum de substrat (glucosa) hi ha un mètodes enzimàtic de la glucosa oxidasa.
Les reaccions que hi tenen lloc són les següents:
La intensitat del color rosa mesurat a 540 nm és proporcional a la concentració de glucosa original. Per poder arribar a mesurar per espectroscopia l'absorbància de les mostres, s'ha de preparar una recta de calibratge, amb tots els reactius presents a les reaccions anteriors.
4.5.1. Preparació de la Glucosa oxidasa/ Peroxidasa reactiva
Materials
- 1 Flascó opac amb tap (aprox.50ml).
- Paper d’alumini
- 1 Micropipeta de fins a 1 ml
- 1 vas de precipitats
- Pipetes aforades de 20ml, 15ml, 2ml
- 1 Pipum
- Puntes de micropipeta
Reactius
- Glucosa oxidasa/Peroxidasa reactiva (Sigma referència G 3660).
Procediment
- Es dipositen 39,2ml d’aigua destil·lada dins el flascó opac.
- S’extreu la càpsula de Glucosa oxidasa/Peroxidasa reactiva del recipient contenidor i s’avoca el contingut dins el flascó opac amb aigua embolcallat amb paper d’alumini i s’agita fins a la dissolució total.
- S’emmagatzema a la nevera entre 2 i 8 ºC . Cal evitar el contacte amb la llum.
4.5.2. Preparació de la o-dianisidina reactiva
Materials
- 1 Micropipeta de fins a 1 ml.
- 1 vas de precipitats
- Puntes de micropipeta
- Paper d'alumini
Reactius
- O-dianisidina reactiva (Sigma referència D 2679).
Procediment
- Es diposita 1ml d’aigua destil·lada dins el flascó embolcallat amb paper d’alumini amb O-dianisidina reactiva i s’agita fins a dissoldre tot el contingut..
- La solució és viable durant tres mesos si s’emmagatzema a la nevera entre 2 i 8 ºC. (descartar si existeix terbolesa).
4.5.3. Preparació del reactiu d'assaig
Materials
- 1 Micropipeta de fins a 1 ml.
- Pipum
- Puntes de micropipeta.
Reactius
- O-dianisidina reactiva (Sigma referència D 2679).
- Glucosa Oxidasa/Peroxidasa reactiva (Sigma referència G 3660).
Procediment
- Es dipositen 0,8 ml O-dianisidina reactiva dins el flascó que conté 39,2ml Glucosa Oxidasa/Peroxidasa reactiva i s’agita fins a dissoldre tot el contingut.
- La solució es viable durant un mes si s’emmagatzema a la nevera entre 2 i 8 ºC (descartar si existeix terbolesa).
4.5.4. Preparació de la solució estàndard de glucosa
Reactius
- Solució estàndard de glucosa (Sigma referència G 3285).
Procediment
- La solució estàndard de glucosa ja ve preparada i conté 1,0 mg/ml de glucosa en 0,1% d’àcid benzoic.
- La solució un cop oberta es viable durant un sis mesos si s’emmagatzema a la nevera entre 2 i 8 ºC (descartar si existeix terbolesa).
4.5.5. Preparació de patrons per la recta de calibratge
Materials
- 1 Micropipeta de fins a 1 ml.
- 2 vasos de precipitats.
- Puntes de micropipeta.
Reactius
- Solució estàndard de glucosa.
- Reactiu d'assaig.
- H2SO4 12N
Procediment
-
Es preparen els patrons i blancs segons la taula següent:
- Un cop preparats aquests patrons s’addicionen 2ml de reactiu d’assaig al primer tub, i s’addicionen a la resta a intervals de 60s.
- Es tapen, es mescla amb molta cura i es posen al bany maria.
- Es deixen reaccionar exactament 30 minuts.
- S’extreu el primer tub del bany i s’addicionen 2ml de H2SO4 12N per parar la reacció . Es fa el mateix amb els altres a intervals de 60 s.
- Es mesura l’absorbància a 540nm i es realitza la corresponent recta de regressió:
4.5.6. Procediment per l'anàlisi de mostres
- Es dipositen 1ml de cada mostra en tubs d’assaig degudament retolats.
- Es prepara bany maria a 37ºC.
- S’addicionen 2ml de reactiu d’assaig al primer tub, i s’addicionen a la resta a intervals de 60s.
- Seguidament es tapa i es posen progressivament al bany maria, un cop transcorreguts 60s de l’ introducció del primer tub al bany s’extreu per parar la reacció i s’addicionen 2ml de H2SO4 12N consecutivament a cada tub.
- Es barreja amb molta cura i es torna a posar al bany maria.
- Es deixen reaccionar al llarg d’un total de 30 minuts.
- Un cop transcorreguts els 30 minuts es mesura l’absorbància.